Projektas "UOSIS: Paprastojo uosio atsparumo patogenui Chalara fraxinea eko-genetinis sąlygotumas"

Pastaruoju metu nuolat pasireiškiant masinio miškų džiūvimo atvejams Europoje, vis problematiškesniais tampa miškų tvarumo išlaikymas ir genetinių išteklių išsaugojimas. Naujos infekcinės ligos yra sukeltos patogenų, kurie dėl klimato pokyčių pakeitė geografinį išplitimą arba pakito tapdami labiau virulentiški. Uosynų džiūvimas pirmiausiai pastebėtas rytų Lenkijoje 1992 metais ir Lietuvoje 1996 metais, o vėliau liga palaipsniui išplito į visas Europos šalis ir jau pasiekė net Ispaniją, Jungtinę karalystę ir Suomiją (Juodvalkis, Vasiliauskas, 2002, Bakys et al., 2009a,b). Europoje pandemine pripažinta paprastojo uosio (Fraxinus excelsior) džiūtis Lietuvoje tęsiasi jau penkiolika metų, tačiau racionalių kovos priemonių su šia liga iki šiol nerasta; visiškai miglotos ir uosio, kaip miško medžio, auginimo perspektyvos. Kai kuriose šalyse jau siūloma įtraukti parastąjį uosį į Raudonąją Knygą. Patogeninio grybo Chalara fraxinea (Kowalski, 2006), (lytinė stadija – Hymenoscyphus pseudoalbidus) sukelta liga mūsų šalyje jau yra įgavusi chronišką pobūdį; praktiškai nebeliko nė vieno nepažeisto medyno, serga tiek seni, tiek jauni medžiai. Ši liga pasižymi neįprastai plačia simptomatika – pažeidžiami lapai, ūgliai, žievė, mediena (1 pav.)


1 pav. Chalara fraxinea sukelti uosių pažeidimai

Jaunesni medžiai žūva dėl asimiliacinio aparato netekimo. Vyresni uosiai dažnai smarkiai apsilpsta, kas sudaro sąlygas šaknų ir kamieno puvinį sukeliančių patogenų atakoms, paprastai pasibaigiančiomis medžio žūtimi. Nustatyta, kad ligos pasireiškimas nepriklauso nei nuo augavietės sąlygų, nei nuo medynų rūšinės sudėties, nei nuo geografinės padėties (Juodvalkis, Vasiliauskas, 2002) – ji pasireiškia visur. Medynai, kuriuose vyrautų uosis, džiūties pradžioje sudarė 2,7% bendro Lietuvos medynų ploto; dabar gi yra likę tik apie 1,8%. Be to, džiūtis tebevyksta, uosynai nuolatos kertami sanitariniais kirtimais, o ir likusieji nepasižymi gera sanitarine būkle. Uosių džiūvimo žala tiek ekonominiu, tiek ir gamtiniu požiūriais yra didžiulė: Europos šalyse uosio mediena paklausi apdailinės medienos pramonėje bei kaip biokuras; ekologine prasme uosis taip pat labai svarbus - tai vertinga kultūrinio kraštovaizdžio, apsauginių ir ūkinių miškų medžių rūšis, sudaranti savitas drėgnų miškų ekosistemas, kurios būtų stipriai pažeistos išnykus karkasiniam komponentui – uosiui. Taip stipriai ligų pažeistuose uosynuose grėsmingai mažėja genetinė įvairovė ir jos gali nebepakakti rūšies fiziologinei bei genetinei adaptacijai užtikrinti, populiacijų tvarumui ir genetiškai pilnaverčiam atsikūrimui užtikrinti, ypač- keičiantis klimatui. Gamtinėse paprastojo uosio populiacijose ir bandomuosiuose želdiniuose pastebima didelė pažeistumo variacija, tačiau randama tik 2-5% išoriškai sveikų medžių (McKinney et al. 2010, Pliūra et al. 2011). Išlieka neaišku, ar šie išoriškai sveiki medžiai yra atsparūs užsikrėtimui ar toleruoja patogeną nesusirgdami, ir kokie yra tokio atsparumo mechanizmai.

Pirmieji genetiniai tyrimai parodė, kad esama genetinių skirtumų pagal atsparumą patogenui C. fraxinea, populiacijų ir šeimų lygmenyje (Pliūra et al. 2007, 2011, Kjear et al. 2011, McKinney et al. 2012), o taip pat - klonų lygmenyje (Stener 2007, Olrik et al. 2007, McKinney et al. 2010), kas teikia vilčių suprasti ligos fitopatologinius, fiziologinius, genetinius ir ekologinius užkrėtimo ir ligos eigos dėsningumus bei padidinti uosių atsparumą selekcinėmis priemonėmis.

Plataus masto moksliniai šios problemos tyrimai, apimančius tiek ligos sukėlėjo biologiją, tiek uosio genetinius tyrimus, tiek ir racionalių kovos būdų paiešką, pradėti daugelyje Europos šalių. Uosių fitopataloginiams tyrimams koordinuoti Europoje inicijuota nauja COST veikla FRAXBACK, šių metų rugsėjo mėnesį Vilniuje įvyko IUFRO mokslinė konferencija, o lapkričio mėnesį vyks COST FRAXBACK projekto konferencija.

Dėl ypač sumažėjusių populiacijų dydžio bei genetinės įvairovės iškilo realus pavojus uosio genetinės adaptacijos galimybėms, jo atskirų populiacijų, ir apskritai uosio, kaip rūšies, išlikimui. Norint pasiūlyti adekvačias priemones uosynų nykimui sustabdyti, degraduotoms populiacijoms atkurti, genetiniams ištekliams išsaugoti ir selekcijai plėtoti, būtina ištirti uosio atsparumo patogenui C. fraxinea genetinės kontrolės specifiką ir atsparumo aktyvavimo mechanizmus. Šiems tyrimams atlikti Lietuvos agrarinių ir miškų mokslų centro Miškų instituto ir Gamtos mokslų centro Botanikos miškų instituto mokslininkai parengė mokslininkų grupės paraišką Lietuvos mokslo tarybą projektui "Paprastojo uosio atsparumo patogenui Chalara fraxinea eko-genetinis sąlygotumas". Laimėjus konkursą, šiam projektui vykdyti 2012-2014 metams skirtas nemažas finansavimas.

Projekto tikslas - ištirti paprastojo uosio populiacijų palikuonių atsparumo patogenui Chalara fraxinea genetinės kontrolės specifiką, atsparumo aktyvavimo mechanizmus ir eko-genetinį atsaką skirtingo ekologinio stresiškumo sąlygomis ir tuo pagrindu parengti rekomendacijas uosynų būklei stabilizuoti bei jiems atkurti.

Projekte numatyta ištirti:

įvertinti kiekvienos populiacijos, šeimos ir klono fenogenetinį plastiškumą, ekovalentingumą ir ekogenetinio atsako pobūdį pagal rezistentiškumą ir kitus adaptacinius požymius.

Tyrimai turėtų suteikti naujų fundamentinių genetinių bei fitopatologinių žinių, o tyrimų rezultatai turėtų platų praktinį pritaikymą – būtų parengtos fitopataloginės ir selekcinės rekomendacijos uosynų būklei stabilizuoti bei jiems atkurti; be to., gautų rezultatų pagrindu būtų atrinkti atspariausi uosio genotipai miško sėklinėms plantacijoms veisti miško dauginamajai medžiagai, skirtai atkurti pažeistus ir žuvusius Lietuvos uosynus, išauginti. Gauta nauja mokslinė informacija bus naudojama Lietuvos uosio genetinių išteklių išsaugojimo, selekcijos ir uosynų atkūrimo programai parengti.

IUFRO konferencijoje, vykusioje šių metų rugsėjo 17-19 d. Vilniuje, LAMMC Miškų institute vykdomo Lietuvos mokslų tarybos mokslininkų grupės projekto “Paprastojo uosio atsparumo patogenui Chalara fraxinea ekogenetinis sąlygotumas” (2012-2014) vykdytojų grupės vardu dr.(HP) A.Pliūra padarė pranešimą „Genetic variation of Fraxinus excelsior clones in susceptability to Chalara fraxinea at juvenile age“, kuriuose pateikė projekte atliktų tyrimų pirmuosius rezultatus.

Tyrimai atliekami 4-uose 2005 metais įveistuose specialaus dizaino eksperimentiniuose želdiniuose, testuojant 320 palikuonių pusiausibų šeimų iš 10 Lietuvos ir 14 Vakarų Europos uosio populiacijų skirtingomis gamtinėmis sąlygomis, ir 2012 metais įveistuose 6-iuose kloniniuose bandymuose miškuose bei klimatinėse kamerose sukuriamomis stresinėmis aplinkos sąlygomis: šalnomis, sausra, padidinta temperatūra bei skirtingo intensyvumo infekciniame fone (2 Pav.). Šie kloniniai bandymai - miško sėklinės plantacijos įveistos 3-se uosio kilmės rajonuose Marijampolės, Šakių, Kuršėnų, Radviliškio ir Kėdainių miškų urėdijose, naudojant 2005 metų serijos uosio palikuonių bandomuosiuose želdiniuose pagal palikuonių išbandymo rezultatus 8 metų amžiuje atrinktų 50 atspariausių ir sparčiausiai augančių klonų medžiagą (29 klonai - iš 5 Lietuvos ir 21 klonas iš 5 užsienio populiacijų). Skiepinukai (4 metų amžiaus) išauginti Dubravos EMMU, kloniniai želdiniai įveisti bendradarbiaujant Valstybinės miškų tarnybos, minėtų miškų urėdijų ir LAMMC Miškų instituto specialistams.


2 pav. Paprastojo uosio 2012 metų serijos kloniniai bandymai-sėklinės plantacijos ir Lietuvos populiacijos, iš kurių kilę klonai


2102 metų pavasarį visuose septyniuose kloniniuose bandymuose buvo atlikti pažeistumo požymių, fenologijos ir augimo tyrimai. Jie parodė, kad 24 klonai (46.2 %) yra visiškai sveiki (3, 4 pav.). Ligos požymiai užfiksuoti ant likusių 28 klonų 5-50 % rametų. Sveikiausi klonai kilę iš trijų Lietuvos populiacijų - Žeimelio, Kėdainių ir Ignalinos, kurių 14 klonų iš 19 testuojamų (74.7 %) neturėjo jokių ligos požymių. Vidutinis klonų pažeidžiamumas (pažeidimų dažnis, išreikštas pažeistų medelių procentu) buvo 10,7 %, dažniausiai medeliai buvo pažeisti Marijampolės ir Šakių kloniniuose bandymuose, atitinkamai 16 ir 18 %, rečiausiai - Šilutės ir Radviliškio - 0 ir 6 %. Medelių sveikatingumo būklė buvo gera - 4,55 balo (penkiabalėje skalėje), o atskiruose kloniniuose bandymuose siekė nuo 4,35 iki 4,86 balo. Vidutinis nudžiūvusio viršūninio ūglio ilgis, kuris atspindi klonų pažeidimo laipsnį (stiprumą) buvo 14,2 cm, stipriausiai medeliai buvo pažeisti Radviliškio ir Kėdainių kloniniuose bandymuose, atitinkamai 23,1 ir 25,9 cm, mažiausiai - Šilutės ir Marijampolės bandymuose - 5,7 ir 9,0 cm.(5 pav.)


3 pav. Paprastojo uosio skirtingų klonų sveikatingumo būklė: a) sveikas medelis, b) Chalara fraxinea pažeista šoninė šakelė, c) pažeistas viršūninis ūglis (ataugęs naujas)



4 pav. Paprastojo uosio skirtingų klonų vidutinis pažeidžiamumas (pažeidimų dažnis - ligos pažeistų medelių santykis su visais medeliais) Chalara fraxinea apimant 6 kloninius bandomuosius želdinius



5 pav. Paprastojo uosio skirtingų klonų pažeidimo laipsnis (vertinamas pagal dėl Chalara fraxinea nudžiūvusio viršūninio ūglio ilgį) apimant 6 kloninius bandomuosius želdinius


Medelių sveikatingumo būklės, pažeidimų dažnumo ir pažeidimo laipsnio variacinė analizė parodė, kad klonų genetinis efektas šiems požymiams yra patikimas. Apimant visus 6 kloninius bandomuosius želdinius sveikatingumo būklės kloninė variacijos komponentė, rodanti klonų įtaką bendram šio požymio kintamumui, siekė 10,5%, o atskiruose bandomuosiuose želdiniuose ji buvo nuo 9,9 % iki 44,2%. Sveikatingumo būklės genetinės variacijos koeficientas siekė 7,2 - 16,1 %, o kloninio paveldėjimo koeficientas - 0.10 - 0.44. Ypač stipriai išreikštas pažeidimo laipsnio, kuris vertinamas pagal nudžiūvusio viršūninio ūglio ilgį, kloninis efektas - variacijos komponentė visame bandyme siekė 28,1 %, o atskiruose bandomuosiuose želdiniuose ji buvo nuo 3,9 % iki 97,2%. Pažeidimo laipsnio genetinės variacijos koeficientas siekė 18,4 - 168,1 %, o kloninio paveldėjimo koeficientas - 0.04 - 0.97. Šie rezultatai rodo, jog esama nemažos atsparumo ligoms genetinės variacijos ir genetinio sąlygotumo. Populiacinis efektas sveikatingumo būklės ir kitiems pažeistumo požymiams nestipriai išreikštas, mat ir nepatikimas, kas buvo sąlygota didelio variavimo tarp klonų populiacijų viduje. Klonai taip pat ryškiai skyrėsi pagal augimą ir pumpurų sprogimo fenologiją, tačiau šie požymiai beveik nekoreliavo su atsparumo/pažeistumo požymiais.

Genetinių parametrų nevienodumas skirtinguose kloniniuose želdiniuose susijęs su nevienodu sergamumo laipsniu atskiruose želdiniuose. Variacinė analizė taip pat parodė, jog klonų sąveikos su aplinka veiksnio įtaka pažeidimų dažnumui ir medelių sveikatingumo būklei yra patikima, o šios sąveikos variacijos komponentė siekia atitinkamai 11,7 % ir 8,6%. Ji rodo, kad klonai pasižymi nevienodu plastiškumu ir kad egzistuoja genetinė variacija pagal fenogenetinį atsaką - pažeistumą (ar atsparumą) skirtingomis aplinkos sąlygomis (skirtingo klimato, augavietės, infekcinio fono).

Tyrimai parodė, kad dalis klonų, atrinktų pagal sėklinių palikuonių išbandymo rezultatus, vis tiek yra pažeidžiami ligos, tačiau pažeidžiamumas mažesnis, o pažeidžiamumo genetinė variacija taip pat sumažėjusi (nes neatspariausi individai nebuvo klonuoti).

Paprastojo uosio klonų sergamumo Chalara fraxinea (H. fraxineus) dinamikos tyrimai 7-se klonų bandymuose, parodė, kad per du metus daugelio atsparesnių genotipų, atrinktų ankstesniuose sėklinių palikuonių bandymuose, klonų atsparumas palaužiamas ir tik dalis jų išlieka iš dalies atsparūs - 23,4 % klonų, kuriuose ligos dažnis < 50 % (6 pav.). Variacinė analizė neparodė reikšmingo populiacinio efekto sergamumo/atsparumo ligoms požymiams, kas gali būti paaiškinama nedideliu populiacijas atstovaujančių klonų skaičiumi bei dideliu tarpkloniniu kintamumu. Tačiau sveikiausi klonai, kaip ir 2012 m., buvo iš trijų Lietuvos populiacijų – Ignalinos, Žeimelio ir Kėdainių. Kiekviename kloniniame bandyme H. fraxineus sukeltos ligos dažnis ir stiprumas buvo skirtingi, o ANOVA parodė patikimą ir didėjančią augimo sąlygų įtaką šiems požymiams. Tačiau sergamumas nesisiejo nei su bandymų edafinėmis, nei su klimatinėmis sąlygomis, todėl labiausiai tikėtina, kad sergamumo skirtumus daugiausiai lėmė skirtingo intensyvumo infekcinis H. fraxineus askosporų fonas iš aplinkinių sergančių medynų. Sergamumo-atsparumo požymių genetinių rodiklių dinamikos tyrimai parodė, jog didėjant sergamumui, genetinis kintamumas ir sąlygotumas išlieka pakankamai aukšti, taigi ir toliau išlieka galimybės uosio atsparumo efektyviai selekcijai. Ligos dažnio kloninės variacijos komponentė (vcc) visame eksperimente padidėjo nuo 8,2 % 2012 m. pavasarį, iki 14,8 % 2013 m. rudenį, o atskiruose kloniniuose bandymuose ji buvo atitinkamai 19,0-70,5 % ir 23,9-63,2 %. Vidutinis paveldėjimo koeficientas (H2) padidėjo nuo 0,33 iki 0,40, Taigi, padidėjus uosių sergamumui, ligos dažnio genetinis kintamumas ir sąlygotumas labiau išryškėjo. Genetinių rodiklių nevienodumus skirtinguose bandymuose lėmė nevienodas sergamumas juose. Sveikatos būklės vcc visame eksperimente padidėjo nuo 13,6 iki 16,4 %, o H2 nežymiai sumažėjo - nuo 0,40 iki 0,38. Viršūninio ūglio nudžiūvusios dalies ilgio vcc sumažėjo nuo 29,9 iki 8,1 %, o H2 - nuo 0,74 iki 0,51, taigi didėjant sergamumui, pažeidimo genetinis kintamumas ir sąlygotumas sumažėja. Daugumos tirtų sergamumo-atsparumo ligoms požymių genotipo (klono) sąveikos su aplinka (G×E) variacijos komponentė sumažėjo, tačiau išlikusi patikima G×E rodo, kad esama genetinės variacijos pagal klonų jautrumą į skirtingo infekcinio fono aplinką. Rasta genotipinė koreliacija tarp fenologijos ir ligos dažnio rodo, kad sergamumas susijęs su augimo ritmu - anksti sprogstantys genotipai atsparesni ligai. Nestipri genotipinė koreliacija tarp ligos dažnio 2012 ir 2013 m. rodo, kad skirtingais metais skirtingi klonai ligos pažeidžiami nevienodu mastu.


6 pav. Paprastojo uosio skirtingų klonų sergamumo dinamika 2012-2014 m.kloniniuose bandomuosiuose želdiniuose


Pusė visų klonų ir rametų 2013 m. liepos mėnesį buvo inokuliuoti grybu Chalara fraxinea ir toliau bus tiriamas tiek inokuliuotų, tiek ir kontrolinių medelių užsikrėtimas, sergamumo eiga ir analizuojami genetinių parametrų pokyčiai (6 pav.). Po kelių metų tikimasi iš išbandomų 50 klonų atrinkti 10-15 pačių atspariausių, skirtų kryžminimams, miško sėklinėms plantacijoms veisti bei vegetatyviniam dauginimui atspariai ligoms sodinamajai medžiagai išauginti.


7 pav. Paprastojo uosio skiepytų medelių inokuliacija Chalara fraxinea kultūra


Grybo H. fraxineus (Chalara fraxinea) sukeliamos ligos eigos tyrimai dešimtyje pusiau sibsų šeimų iš dviejų Lietuvos uosio populiacijų jauname amžiuje tiek kontrolinėmis aplinkos sąlygomis, tiek ir klimatinėje kameroje (8. pav.), paveikus dirbtine pavasarine šalna ir vasaros sausra, parodė, kad ligos dažnis per tris metus labai padidėjo ir 2014 m. rudenį po šalnų poveikio pasiekė 81 %, po sausrų poveikio - 95 % ir 90 % normaliomis lauko sąlygomis (kontrolinis variantas). Medžių mirtingumas buvo mažesnis šalnų poveikio bandymo variante (siekė 21 %) nei sausros poveikio (25 %) ar kontroliniame bandymų variante (31 %). Tačiau ligos dažnumui tirtų stresorių poveikių įtaka nebuvo patikima (P>0.05). Jungtinė dispersinė analizė parodė reikšmingą (P<0.05) neigiamą poveikių šalnomis ir sausra įtaką tik nekrozinių šakų ilgiui, kuris apibūdina ligos plitimo greitį ir ligos intensyvumą medyje. Buvo stebimi H. fraxineus sukeliamos ligos dažnio ir pažeistumo skirtumai tarp skirtingas populiacijas atstovaujančių šeimų tiek pavasario šalnų tiek ir vasaros sausrų poveikio variantuose, tačiau dispersinė analizė neparodė reikšmingo populiacinio efekto, kas matyt lėmė didelis kintamumas tarp šeimų esant palyginus mažam tirtų šiame bandyme populiacijų skaičiui. Skirtingai nei 2012 ir 2013 metais, 2014 metais nebeliko šeimų, visiškai atsparių ligai, tačiau išliko ryškūs skirtumai tarp šeimų pagal ligos dažnį šeimose ir pažeidimų intensyvumą, kas rodo daugelio genų nulemtą adityvinį atsparumo paveldėjimo pobūdį. Viena iš tirtų šeimų pasižymėjo ženkliai mažesniu sergamumu prieš poveikį stresoriais bei rudenį po paveikiu šalna ir sausra. Šešios šeimos parodė mažesnį už vidutinį sergamumą (ligos dažnį) tik atskiruose bandymų variantuose. Nustatyta, kad dvi atsparesnės šeimos pasižymėjo ankstyvesne pumpurų sprogimo fenologija, tuo patvirtindamos ankstesniuose mūsų ir kitų autorių tyrimuose stebėtą dėsningumą, rodantį, kad medžio sugebėjimas priešintis infekcijai susijęs su medžių genotipų fiziologijos specifika.



8 pav. Uosio pusiausibų palikuonių šeimų bandymai dirbtinių šalnų ir sausrų streso poveikyje LAMMC Miškų instituto klimatineje kameroje


Tyrimai parodė, kad tiek dirbtinė pavasario šalna, tiek ir vasaros sausra ženkliai padidino medžių sveikatos būklės adityvinę genetinę (CVa) ir paveldėjimą (ha2), kas rodo jog stresinės sąlygos išryškina genetinius skirtumus tarp šeimų. Nekrozinių šakų ilgio genetiniai parametrai padidėjo kontroliniame bandymų variante ir po šalnų poveikio, tačiau sumažėjo po vasaros sausrų poveikio. Aukštesni genetinės variacijos koeficientai tam tikromis stresinėmis aplinkos sąlygomis rodo geresnes galimybes įvertinti šeimų atsparumą, atlikti šeimų atranką ir gauti didesnį selekcijos efektą (genetinę naudą). Didesni paveldėjimo koeficientai rodo, kad stresinėmis sąlygomis galima tiksliau identifikuoti atsparesnius genotipus pagal jų fenotipą ir vykdyti efektyvesnę individualią atranką šeimose. Kadangi viršūninio ūglio ligos pažeidimo intensyvumo genetiniai parametrai padidėjo tiek stresinėmis aplinkos sąlygomis, tiek ir kontrolinėmis sąlygomis, tai šis padidėjimas gali būti sąlygotas ne stresorių įtakos, bet bendro ligos vystymosi dėsningumų.

Patikima (P<0.05) šeimos genotipo sąveika su stresine aplinka (G×E) nustatyta ligos sutinkamumui ir nekrozinių šakų suminiam ilgiui. Tai rodo esant genetinei variacijai pagal plastiškumą ir atsako pobūdį (reakcijos normas). Pagal nekrozinių šakų ilgio kintamumą skirtingomis stresinėmis aplinkos sąlygomis didesnei daliai šeimų (70%) buvo nustatyti reikšmingi (P<0.05) Wricke ekovalentingumo koeficientai, rodantys, kad šios šeimos reikšmingai prisidėjo prie G×E sąveikos. Žymiai mažesnė dalis šeimų (40%) pasižymėjo reikšmingais sveikatos būklės ekovalentingumo koeficientais. Kadangi stebimą plastiškumą lėmė medžių būklės pablogėjimas dėl ligos, tai šis plastiškumas negali būti laikomas adaptaciniu. Adaptacinė plastiškumo reikšmė priklausys nuo reakcijos normų ir šeimų sveikatos būklės konkrečiomis aplinkos sąlygomis.



9 pav. Dr.(HP) A.Pliūra demonstruoja seminaro dalyviams paprastojo uosio bandymus šiltnamyje





Literatūra